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1共焦显微原理与系统方案 基于针孔式扫描盘建立的快速共焦显微系统的结构如图1所示,激发光源发出的光经过准直、扩束之后,透过分光镜,依次经过快速扫描盘和显微物镜。物镜汇聚的激发光照射在样品上,样品受激发射的荧光按照原光路返回,当发射荧光经过快速扫描系统时
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  1共焦显微原理与系统方案

  基于针孔式扫描盘建立的快速共焦显微系统的结构如图1所示,激发光源发出的光经过准直、扩束之后,透过分光镜,依次经过快速扫描盘和显微物镜。物镜汇聚的激发光照射在样品上,样品受激发射的荧光按照原光路返回,当发射荧光经过快速扫描系统时,被滤去物方非焦面发射的杂散光。分光镜反射的荧光经过透镜汇聚后被CCD接收,获取样品共焦显微图像。通过控制样品在Z轴上步进,进而改变样品的光切位置,可以获得样品不同切面的图像,最终通过一定的图像处理技术可以获得样品的三维图像。

  2EMCCD相机结构与组件内容

  图1所建立的共焦显微系统以针孔盘作为扫描部件,它以多点针孔同时对视场进行扫描,因此,图像采集器件宜采用面阵器件,综合探测灵敏度、图像输出帧频、空间应用等角度考虑,系统采用EMCCD作为图像采集器件。它与传统CCD器件在感光、存储等结构上并无差异,之所以在探测灵敏度、信噪比上表现出色,是因为在其读出寄存器之后又多出了一串增益寄存器,增益寄存器的单个倍增单元如图2所示。与普通的三相CCD转移电极相比,EMCCD将Ф2分为Ф2和Фdc,一般Фdc接2V左右的直流偏置,Ф2接高压(40V左右)转移时钟,由于Ф2与Фdc之间存在高压差,当信号电荷从Ф1向Ф2转移时,强电场会使电荷加速并与其他电荷碰撞产生新的电子,电子被Ф2势井收集实现1次信号倍增。单个倍增单元的倍增率是随机的,一般在1%~1.5%范围内,虽然单个倍增单元增益很低,但当多个倍增单元级联时,总增益由式(1)确定G=(1+g)n.(1)其中,g为单个倍增单元的倍增率,n为倍增单元数,当n取500时,总增益可能达2000倍以上。系统采用英国E2V公司的CCD97器件作为成像探测器[3],CCD97是减薄背照式帧转移型EMCCD,具有512×512有效像素,像素尺寸为16μm×16μm,它同时具有普通模式与倍增模式成像方式,相应具有两路读出放大器。倍增模式下制冷到-40℃,可达30photons/pixel/s(积分时间为0.1s)的探测能力,满足弱光探测需求,同时在11MHz像素时钟下,噪声低于1电子/pixel,量子效率达90%以上,满足高帧频需求。整套系统的电子学设计围绕EMCCD的驱动需求展开,按功能主要划分为3个模块:逻辑驱动模块、功率驱动模块和上位机图像采集模块,系统功能框图如图3所示。

  2.1逻辑驱动模块

  逻辑驱动模块主要完成EMCCD帧转移、行转移、行输出等逻辑信号输出、AD时序控制输出、SRAM时序控制输出以及图像数据串行输出等功能,逻辑模块核心器件采用ACTEL公司的APA300器件,它基于Flash技术,无需配置芯片,功耗低,对固件错误有较好的免疫作用,可以抵御一些高能粒子的冲击,最大优势在于在特殊环境下可以稳定可靠地工作,适合航天领域的应用。图像信号采集部分用AD9824,它是ADI公司一种专用于CCD信号处理的AD器件,它包含14位精度最高采样率为30MSPS的A/D转换器,芯片内部集成了相关双采样电路、像素增益放大器、可编程增益放大器。逻辑驱动模块的硬件程序各子模块的调用关系如图4所示。

  2.2功率驱动模块

  CCD97的驱动除了对信号相位要求严格外,还要求信号电平和上升时间多样化,针对不同信号的电平和上升时间需求,功率驱动模块采用4种电路方案,包括偏置电平电路、图像转移信号电路(ФIS,ФR)及高压时钟电路。由于CCD97直流偏置所需电流不大,所以,偏置电平电路采用电阻分压与运放跟随实现。图像转移信号上升时间较短,需要较大的驱动电流,图像帧转移、行转移、行输出信号功率驱动电路以EL7457作为核心器件。它是Elantec公司推出的四通道CMOS专用驱动器,最高工作频率可达40MHz,最大驱动电流2A,具有低输出阻抗、外围电路简单、方便电源管理等优点,非常适用于多电平复杂时序的CCD器件驱动设计。图像转移信号功率驱动电路如图5所示[4],由于ФI,s,ФR信号的上升时间要求不同,实际调试电路时选择合适的电阻器(R1~R5)使得信号上升时间尽量满足器件需求,保证输出的图像质量较高。高压时钟是实现倍增模式成像的关键信号,它的电平决定了倍增增益,并最终影响器件在低照度下的成像效果。由于高压时钟的电平较高,一般在40V左右,驱动电流100mA左右,使用集成元件很难实现,所以,高压时钟电路采用分立元件实现,电路如图6所示[5]。图中电路的静态偏置由二极管D1,D2,D3,D4,D5,D6以及电阻器R1,R3,R4所组成的分压网络提供。Q1的栅源极静态电压约为-1V,Q2的栅源极静态电压约为1V。当FPGA驱动脉冲为低时,U1和U2的输出为5V,Q1的栅源极电压为-1V,Q2的栅源极电压为6V,此时,Q1关断,Q2导通,2HV被拉低到0V;当FPGA脉冲为高时,U1和U2的输出为0V,Q1的Vgs为-6V,Q2的Vgs为1V,此时Q2关断,Q1导通,Ф2HV被拉高到电源电压Vhigh。Ф2HV的输出相位与FPGA输出逻辑信号相同,高低电平与高压电源一致。

  2.3上位机软件

  上位机控制软件主要负责指令编码、指令下传以及图像数据接收、图像数据存储、图像显示等工作。上位机软件开发环境为VC++6.0,通过调用操作系统自带的MScomm控件完成指令下传与数据接收。通过点击界面上的“打开串口”按钮建立相机与上位机间的通信,点击“打开相机”按钮完成相机参数与开机指令下传,开启图像数据接收线程,待正确接收数据包头并完成一整幅图像数据接收后,显示接收图像并保存图像数据。

  3图像采集验证与分析

  验证实验镜头采用MV2514机器视觉镜头,该镜头放大倍率为0.23倍,焦距为25mm,F数可小至1.4,可见光波段内透过率约90%,机械接口为标准C接口,可兼容2/3inCCD,最小工作距130mm。实验中采用6mm特写环在0.01lx微光、100ms积分时间、2dB增益条件下使用普通模式与倍增模式分别对同一目标成像,图像如图7所示。从获得的暗背景条件下的图像数据可计算出噪声平均灰度值与方差,分别选择普通模式下与倍增模式下目标图像的最亮点作为信号,取多幅图像数据的亮点信号并计算平均值,可以获得普通模式下与倍增模式下的信噪比,列于从表中可以得出:相比普通模式,在44V倍增时钟电压驱动下,倍增模式输出图像的信号有7倍提升,信噪比也有8倍提升,证明CCD97在微弱光条件下,使用倍增模式可以获得较高质量的目标图像。根据图1搭建共焦显微系统,使用40倍物镜对拟南芥进行荧光显微成像。普通显微模式与共焦显微模式分别对样品所成图像如图8所示。EMCCD相机倍增模式与普通模式使用相同AD增益,积分时间分别取100,50ms。从图8可以看出:EMCCD在倍增模式下可以获得比较清晰的拟南芥叶肉共焦显微荧光图像。相比普通显微模式,由于对样品进行光切的原因,使得系统在共焦显微模式下可以清晰的分辨出拟南芥叶肉叶绿体。

  4结论

  通过对空间生命科学实验中共焦显微的原理分析,提出一套适用于活体目标观察、对样品低损伤的共焦显微方案。根据目标的扫描方案和获取目标发射光的能量大小提出基于CCD97的弱光图像采集系统,将系统分成3个功能模块分别实现并最终完成原理样机研制。在普通模式与倍增模式下分别获取目标图像,从图像效果可以看出:该成像系统性能较高,对弱光目标有很好的成像效果,且该系统具有体积小、可靠性高、适合空间应用等特性。


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